Wie man ein Fluorometer baut
Ein Fluorometer, auch Spektrofluorometer genannt, ist ein Instrument, das in der Lage ist, die optische Fluoreszenz von einem oder mehreren Fluorophoren zu messen. Auf dieser Seite veranschaulichen wir die Grundlagen eines Fluorometer-Designs.
Mehr über die Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie erfahren Sie, indem Sie hier klicken oder unser Video-Tutorial hier ansehen.
Es gibt viele Arten und Bezeichnungen für Instrumente, die Fluoreszenz messen können, wie Fluorometer, Fluorimeter, Fluoreszenzspektralphotometer und Mikroplattenleser. Eine detailliertere Beschreibung finden Sie hier. Ein Fluorometer wird im Allgemeinen verwendet, um ein Instrument mit einer bestimmten Anwendung im Auge zu beschreiben, wie z. B. Chlorophyllmessungen.
Die Funktion eines Fluorometers besteht darin, die Probe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zu beleuchten und das emittierte Fluoreszenzlicht der Probe bei einer oder mehreren Wellenlängen zu messen. Die Abbildung unten zeigt den grundlegenden Aufbau eines Fluorometers.
Ein Fluorometer besteht aus den folgenden grundlegenden Komponenten:
Im Folgenden werden die verschiedenen Komponenten detaillierter beschrieben.
Die üblicherweise für Fluorometer verwendeten Lichtquellen sind Leuchtdioden (LEDs) aufgrund ihrer kompakten Größe, relativ geringen Kosten und des guten Wirkungsgrades. LEDs sind mit vielen verschiedenen Mittenwellenlängen erhältlich und decken typischerweise eine Bandbreite um die Mittenwellenlänge von 10 – 50 nm ab. Die Wahl der LED hängt von der Anregungswellenlänge ab, die Sie für Ihr Fluorophor benötigen. Als Beispiel absorbiert Chlorophyll Licht sowohl im blauen (465 nm) als auch im roten (665 nm) Bereich. Daher sollten Sie eine weiße LED verwenden, die das gesamte sichtbare Spektrum als Anregungsquelle abdeckt (siehe ein Beispiel hier). Alternativ können Sie auch nur eine blaue LED verwenden (z. B. eine 465 nm LED wie die hier). Die LED emittiert im Allgemeinen Licht in einem Kegel um die Hauptrichtung des Lichts, daher kann es oft vorteilhaft sein, eine Kollimationslinse vor der LED einzusetzen.
Um die Menge an direktem Licht von der LED zu begrenzen, das auf dem Detektor landet, wo es das viel schwächere Fluoreszenzsignal stören kann, wird normalerweise ein Kurzpass-optischer Filter als Anregungsfilter verwendet. Ein gutes Beispiel ist Chlorophyll, das einen Absorptionspeak bei 665 nm und einen Emissionspeak bei 673 nm aufweist. Wenn wir eine LED bei 660 nm verwenden, emittiert diese auch erhebliche Mengen an Licht im Bereich von 670 – 680 nm, so dass es schwierig sein kann, dieses Licht vom Fluoreszenzsignal von Chlorophyll zu trennen, wie in Abbildung a) unten dargestellt. Wenn ein Kurzpassfilter mit der Kante bei 665 nm verwendet wird, wird es viel einfacher, die Fluoreszenz zu messen, wie in Abbildung b) dargestellt.
Die Wahl des Probenhalters hängt wirklich von der Anwendung ab. Der Hauptaspekt ist, dass Sie im Falle einer transmissiven Küvette oder Durchflusszelle sicherstellen müssen, dass das Probenhaltermaterial sowohl für Ihre Anregungs- als auch für Ihre Emissionswellenlänge transparent ist. Dies ist besonders wichtig für UV-Wellenlängen, bei denen die meisten Gläser Licht absorbieren, so dass spezielle Materialtypen verwendet werden müssen.
Die Funktion des dichroitischen Strahlteilers besteht darin, die kürzeren Wellenlängen zu reflektieren und die längeren Wellenlängen zu transmittieren. Auf diese Weise wird das Anregungslicht von der LED zur Probe geleitet, während die gesammelte Fluoreszenzemission zum Detektor geleitet wird. Ein Beispiel für einen dichroitischen Strahlteiler für 650 nm ist hier zu sehen.
In einigen Fällen, in denen mehrere Emissionswellenlängen gleichzeitig gemessen werden sollen, kann mehr als ein dichroitischer Strahlteiler verwendet werden, wie in der Abbildung unten dargestellt.
Der letzte Teil des Fluorometers ist der Detektor. Der Detektor wandelt Licht (Photonen) in ein elektronisches Signal in Form von elektronischer Ladung, Strom oder Spannung um. Es ist üblich, einzelne Photo-Multiplier Tubes oder Silizium-Photodetektoren zu verwenden. Wenn Sie jedoch mehrere Fluorophore und Peaks analysieren müssen, kann es vorteilhafter sein, ein Diodenarray-Spektrometer wie unser PEBBLE VIS zu verwenden. Ein solches Gerät erfasst das vollständige Spektrum aller Peaks, die bei mehreren hundert Wellenlängen abgetastet werden. Ein Designbeispiel ist in der folgenden Abbildung dargestellt.
Measuring Fluid Fluorophores with our PEBBLE Spectrometer
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