Fluoreszenz-Instrumentierung
Dieser Leitfaden gibt Ihnen einen Überblick darüber, wie Sie die richtigen Komponenten für Ihr Fluoreszenzspektroskopie-Instrument auswählen.
Es gibt grundsätzlich zwei Arten von Fluoreszenzspektroskopie-Instrumentenkonfigurationen – transmissiv und reflektiv, wie in den Abbildungen unten dargestellt. Der einzige wirkliche Unterschied zwischen den beiden besteht darin, dass in der reflektierenden Version ein dichroitischer Spiegel verwendet wird, um das Anregungslicht auf die Probe zu lenken und das Emissionslicht von der Probe zu sammeln, während in der Transmissionskonfiguration die Probe direkt von der Lichtquelle angeregt wird und das Emissionslicht in einem Winkel von 90 Grad gemessen vom Anregungslicht gesammelt wird.
Ein Fluoreszenzinstrument besteht aus den folgenden grundlegenden Komponenten:
Es gibt viele Auswahlmöglichkeiten für jede Art von Komponente, und diese Auswahl hängt in erster Linie von den Fluorophoren ab, die Ihr Instrument analysieren können soll.
Nachfolgend finden Sie eine Grafik, die die beiden Extreme zeigt. An einem Ende haben Sie ein sehr einfaches Instrument, das nur einen einzelnen Fluorophor mit einer Anregungs- und einer Emissionswellenlänge und ohne zeitaufgelöste Experimente analysieren soll. Im Gegensatz dazu befindet sich am anderen Ende der Skala das fortschrittlichste und komplizierteste Instrument, bei dem Ihr Instrument die Flexibilität haben muss, eine beliebige (unbekannte) Anzahl von Fluorophoren mit mehreren Anregungs- und Emissionswellenlängen und mit der Option zur Durchführung zeitaufgelöster Experimente zu analysieren. Für die meisten Anwendungen muss sich das Instrument jedoch irgendwo zwischen diesen beiden Extremen befinden.
Im Folgenden werden die Komponenten im Inneren des Fluoreszenzinstruments detaillierter beschrieben, so dass Sie besser beurteilen können, was für Ihre spezifische Anwendung geeignet ist.
Für die Fluoreszenzspektroskopie kann fast jede Art von Lichtquelle verwendet werden, so dass die beste Wahl von den tatsächlichen Anforderungen an spektrale Wellenlängenabdeckung, Intensität, Größe, Kosten, Effizienz und der Frage abhängt, ob die Lichtquelle gepulst werden muss.
Die obige Tabelle listet die gängigsten Arten von Lichtquellen und deren Hauptmerkmale auf. Im Allgemeinen sind LEDs eine gute Wahl, wenn Sie ein kostengünstiges, kompaktes Fluoreszenzinstrument zur Analyse einer begrenzten Anzahl bekannter Fluorophore bauen möchten. Gepulste Tischlaser sind oft die bevorzugte Wahl, wenn Sie sehr genaue, zeitaufgelöste Messungen mit Nanosekunden-Timing benötigen. Und Breitbandquellen sind die beste Wahl, wenn Sie die Flexibilität benötigen, eine große Anzahl unbekannter Fluorophore zu analysieren und somit fast jede Anregungswellenlänge auswählen müssen.
Die Anregungsfilter lassen sich in zwei Kategorien einteilen:
- Feststehende Tiefpass-/Bandpassfilter
- Variable Bandpassfilter
Variable optische Bandpassfilter werden meist als Raster-Gittermonochromatoren realisiert und zusammen mit Breitband-Lichtquellen verwendet, um die richtige Anregungswellenlänge auszuwählen. Der Hauptvorteil ist natürlich die Flexibilität, jede beliebige Wellenlänge zu wählen, aber der Nachteil sind hohe Kosten, große Abmessungen, die Notwendigkeit einer elektronischen Steuerung und Stabilitätsprobleme aufgrund der beweglichen Teile im Inneren des Monochromators. Daher werden variable Bandpassfilter hauptsächlich in vielseitigen, großen Laborinstrumenten eingesetzt. Die Hauptvorteile der festen Filter sind, dass sie klein, einfach, relativ kostengünstig und sehr stabil sind. Der Preis, den man zahlt, ist jedoch eine eingeschränkte Flexibilität bei der Wahl der Anregungswellenlänge. Einige Instrumente bieten die Möglichkeit, zwischen einer Reihe von Filtern mit unterschiedlicher Mittenwellenlänge zu wählen. Aus diesem Grund werden Festfilter meist in handheld/tragbaren, kostengünstigeren Fluoreszenzinstrumenten für spezielle Anwendungen eingesetzt.
Die Wahl des Probenhalters hängt wirklich von der Anwendung ab. Der Hauptaspekt ist, dass Sie im Falle einer transmissiven Küvette oder Durchflusszelle sicherstellen müssen, dass das Probenhaltermaterial sowohl für Ihre Anregungs- als auch für Ihre Emissionswellenlänge transparent ist. Dies ist besonders wichtig für UV-Wellenlängen, bei denen die meisten Gläser Licht absorbieren, so dass spezielle Materialtypen verwendet werden müssen.
Der dichroitische Filter wird in einer 45-Grad-Konfiguration verwendet. Die Funktion des dichroitischen Filters besteht darin, das Anregungslicht (kürzere Wellenlängen) zu reflektieren und das Emissionslicht (längere Wellenlängen) zu transmittieren. Bei sehr einfachen Systemen kann der dichroitische Filter tatsächlich sowohl als Anregungs- als auch als Emissionsfilter fungieren.
Die Emissionsfilter lassen sich in drei Kategorien einteilen:
- Feststehende Low-Bandpassfilter
- Variable Bandpassfilter
- Vollspektrum-Diodenarray-Spektralphotometer
Variable optische Bandpassfilter werden meist als Raster-Gitter-Monochromatoren realisiert und zur Auswahl der richtigen Peak-Emissionswellenlänge verwendet. Der Hauptvorteil ist natürlich die Flexibilität, jede beliebige Wellenlänge zu wählen, aber der Nachteil sind hohe Kosten, große Abmessungen, die Notwendigkeit einer elektronischen Steuerung und Stabilitätsprobleme aufgrund der beweglichen Teile im Inneren des Monochromators. Daher werden variable Bandpassfilter meist in vielseitigen, großen Laborinstrumenten eingesetzt. Der Hauptvorteil der festen Filter ist, dass sie klein, einfach, relativ kostengünstig und sehr stabil sind. Der Preis, den Sie zahlen, ist jedoch eine eingeschränkte Flexibilität bei der Wahl der Emissionswellenlänge. Sie können Ihr Fluoreszenzinstrument mit mehreren Filtern auslegen, aber wenn Sie mehr als 3 - 4 Filter benötigen, wird es sehr schnell sperrig und teuer. Vollspektrum-Diodenarray-Spektralphotometer erfassen - wie der Name schon sagt - das gesamte Spektrum. Das bedeutet, dass Sie alle Emissionspeaks und Details über ihre Form und den Hintergrundpegel haben. Aus diesem Grund sind Diodenarray-Spektralphotometer eine gute Wahl, wenn Sie mehrere Fluorophore und/oder komplexere Spektren messen wollen.
In der Fluoreszenzspektroskopie werden häufig Photomultiplier (PMT) als Detektoren verwendet, da diese Detektoren eine hohe Empfindlichkeit und ein schnelles Ansprechverhalten aufweisen. Es können aber auch siliziumbasierte Festkörperdetektoren verwendet werden.
Die Anzahl der benötigten Detektoren hängt von der Systemkonfiguration ab, wie in der obigen Abbildung dargestellt. Wenn Sie einen variablen Bandpassfilter (wie einen Monochromator) verwenden, benötigen Sie nur einen Detektor. Wenn Sie feste Bandpassfilter verwenden, benötigen Sie einen Detektor pro Filter. Wenn Sie jedoch mehrere Emissionswellenlängen analysieren möchten, wird dies sehr schnell sperrig und teuer, und ein Diodenarray-Spektrometer ist die bevorzugte Option. Das Diodenarray-Spektrometer umfasst typischerweise Hunderte von Detektoren. Die Verwendung eines ultrakompakten Diodenarray-Spektrometers wie unseres PEBBLE VIS zeichnet das vollständige Spektrum aller Peaks auf, die bei mehreren hundert Wellenlängen abgetastet werden.
Weitere Diodenarray-Spektralphotometer könnten unser kompaktes FREEDOM VIS-Spektrometer sein, das kosteneffizient und leistungsstark ist, sowie unsere High Throughput ROCK VIS-Spektrometer für ihre kompromisslose Leistung.
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